Detecção de espécies reativas de oxigênio em células tumorais mamárias durante terapia fotodinâmica por meio de ressonância paramagnética eletrônica

Abstract

A terapia fotodinâmica (TFD) tem se mostrado promissora no tratamento de diversos tipos de câncer, incluindo o de mama. Essa abordagem se baseia na interação entre um fotossensibilizador, luz e oxigênio molecular. O fotossensibilizador ativado pela luz reage com o oxigênio molecular presente nas células, gerando espécies reativas de oxigênio (ERO), que são altamente tóxicas para as células cancerosas, levando à sua destruição. Por muitos anos, o oxigênio singleto foi considerado a principal ERO envolvida na TFD. Entretanto, o papel dos radicais centrados em oxigênio, como o superóxido, tem sido discutido com mais frequência em protocolos de TFD. O objetivo deste estudo foi padronizar um método de detecção de radical superóxido por ressonância paramagnética eletrônica (RPE), utilizando marcadores de spin da classe das hidroxilaminas cíclicas, em cultura de células tumorais mamárias submetidas à TFD. Utilizamos azul de metileno como agente fotossensibilizador em células murinas 4T1, gerando ERO mediante ativação com luz de LED de 660 nm. A detecção da produção total de ERO foi feita com o marcador de spin CMH, que é permeável à célula e que, após reação com estes radicais, gera um sinal de nitróxido que pode ser quantificado por espectroscopia de RPE. Os resultados demonstraram que, após a irradiação com luz de LED, o azul de metileno promoveu um aumento de cinco vezes na produção total de ERO em células tumorais. O pré-tratamento das células com superóxido dismutase (SOD) impermeável promoveu atenuação na concentração de nitróxido em 53,9%, fornecendo estimativa da produção extracelular de radical superóxido. Já a formação intracelular de superóxido foi estimada pelo tratamento com PEGSOD, que é permeável às células. Confirmamos a utilidade do marcador de spin específico mitocondrial mito-TEMPO-H em células 4T1 para medir o aumento de 243% da formação do superóxido mitocondrial gerado após TFD. Em conclusão, foi possível estabelecer um protocolo de detecção de superóxido em diferentes compartimentos celulares após TFD, envolvendo a combinação de marcadores de spin e enzimas com diferentes permeabilidades celulares e marcadores de spin projetados para acumular-se rapidamente nas mitocôndrias, permitindo a obtenção de informações exclusivas sobre a localização da produção de superóxido.