Estratégia molecular para edição gênica do inibidor Bowman-Birk majoritário em sementes de soja

Abstract

A soja (Glycine max (L.) Merrill) é uma das principais fontes mundiais de proteína vegetal; contudo, seu aproveitamento nutricional é limitado pela presença de fatores antinutricionais, notadamente os Inibidores de Protease do tipo Bowman-Birk (BBI). Estas proteínas, altamente estáveis termicamente devido à sua estrutura rica em pontes dissulfeto, inibem a tripsina e a quimotripsina no trato digestivo de monogástricos, reduzindo a digestibilidade proteica e podendo causar hipertrofia pancreática. O presente estudo teve como objetivo o desenvolvimento de linhagens de soja da cultivar brasileira BRS 537 com teor reduzido de BBI, utilizando a tecnologia de edição genômica CRISPR/Cas9 para o knockout do gene Glyma.16G208900. A seleção deste gene como alvo prioritário baseou-se em análises in silico e validação experimental por RT-qPCR, que confirmaram sua expressão predominante durante o enchimento dos grãos. Análises estruturais via AlphaFold v2 e docking molecular atestaram a competência do modelo para a inibição bivalente (“cabeçadupla”). A estratégia de transformação genética mediada por Agrobacterium tumefaciens em eixos embrionários maduros resultou na regeneração de 220 plantas aclimatadas, com uma eficiência de transformação de 56,8%. Dentre os dois sgRNAs avaliados, apenas o sgRNA1 mostrou-se eficiente no direcionamento do complexo CRISPR/Cas9 ao gene alvo. Essa especificidade permitiu a identificação de 10 eventos de edição na geração T0 (Eventos 23, 32, 85, 88, 34, 21, 18, 84, 31 e 22), os quais exibiram uma diversidade de padrões mutacionais, incluindo deleções de −9 pb e −10 pb, além de inserções de +1 pb e +3 pb entre outros. Essas alterações geraram tanto mutações do tipo frameshift, que levam à formação de códons de parada prematuros, quanto deleções in-frame, capazes de desestabilizar domínios estruturais críticos, ambas viabilizando a perda funcional da proteína alvo. Esses resultados ratificam a eficiência e a viabilidade da edição gênica na cultivar BRS 537, estabelecendo uma base para o desenvolvimento de soja com qualidade nutricional superior.