Desenvolvimento de teste molecular de triagem neonatal para quantificação de TREC e KREC

Abstract

Durante a maturação linfocitária, a recombinação somática dos receptores de antígenos gera círculos de DNA extracromossômicos, conhecidos como TREC (círculos de excisão de células T) e KREC (círculos de excisão de células B). A quantificação desses marcadores permite avaliar a competência do sistema imunológico, sendo fundamental para o rastreamento de imunodeficiências primárias, como a síndrome de DiGeorge, a agamaglobulinemia ligada ao X e a imunodeficiência combinada grave (SCID). A SCID é uma doença genética rara caracterizada por comprometimento da funcionalidade dos linfócitos T, B e/ou células NK, tornando os recém-nascidos altamente suscetíveis a infecções persistentes e recorrentes. Se não diagnosticada precocemente, a SCID pode levar a óbito nos primeiros meses de vida ou causar sequelas severas caso o tratamento seja tardio. Este estudo validou um ensaio de qPCR multiplex para a triagem neonatal da SCID e outras imunodeficiências, baseado na quantificação dos TRECs e KRECs. Para a padronização, foram utilizados plasmídeos como calibradores, além de 181 amostras biológicas para validação analítica e clínica. A análise envolveu o comparativo com 2 laboratórios de apoio que já realizam o teste: laboratório de Apoio 1 com 57 amostras de recém-nascidos, laboratório apoio 2 com 40 amostras e 84 amostras foram utilizadas em comparação com o kit comercial NeoScreen SMA/TREC/KREC Real-Time Detection da empresa DNA Technology. O DNA foi extraído de discos de 3 mm de papel filtro utilizando o kit Generation DNA (QIAGEN). A reação de qPCR foi realizada no termociclador CFX96 (Bio-Rad) utilizando primers específicos para TREC e KREC (sintetizados pela IDT), além da amplificação do gene RNAseP como controle interno para normalização da quantidade de DNA. As condições otimizadas incluíram primers e sondas a 0,8 μM e 0,4 μM, respectivamente, com protocolo de amplificação: 50 °C/120 s, 95 °C/10 min, seguido de 45 ciclos de 95 °C/5 s, 55 °C/15 s e 65 °C/45 s. A validação do método demonstrou eficiência de amplificação superior a 98%, coeficiente de determinação (r² ≥ 0,99) e um limite de detecção (LOD) de 8 cópias por reação para o equivalente a 13 Cópias/uL de sangue. Foram feitos ensaios de precisão, repetibilidade e reprodutibilidade. Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética sob o parecer CAAE: 80346424.8.0000.0257. A implementação deste teste de triagem neonatal pode viabilizar diagnósticos precoces e intervenções terapêuticas oportunas, contribuindo para um prognóstico mais favorável em pacientes com SCID e outras imunodeficiências primárias.