Desenho, construção e avaliação de um biossensor toehold switch para detecção de influenza aviária H5N1

Abstract

A Influenza Aviária (IA), causada pelo vírus da família Orthomyxoviridae, é uma grave ameaça à saúde pública e à economia global. O vírus do tipo A, de maior importância epidemiológica, possui genoma segmentado em oito fitas de RNA simples negativa que codificam proteínas essenciais como Hemaglutinina (HA) e Neuraminidase (NA). O subtipo H5N1, classificado como de alta patogenicidade, apresenta elevada capacidade de mutação e salto zoonótico, com o clado 2.3.4.4b consolidado como linhagem dominante, associado a altas taxas de mortalidade em aves e mamíferos. Diante da necessidade de métodos diagnósticos rápidos e descentralizados, este trabalho avaliou experimentalmente um biossensor baseado em Toehold switches integrado ao sistema de expressão gênica livres de células para detecção dos genes H5 e N1. O design in silico de seis sensores candidatos foi realizado no software NUPACK, com base em regiões conservadas do vírus, seguido pela construção de um sistema de dois plasmídeos: um módulo de detecção (expressando integrase 13) e outro de resposta (contendo o gene da EPIC luciferase). Os ensaios foram conduzidos com o sistema T7 S30 Extract System for Circular DNA. A triagem inicial com RNA sintético permitiu selecionar os sensores H5-b e N1-f, que apresentaram melhor desempenho em curvas de dose-resposta. As condições ótimas foram definidas em 45,5 ng de DNA para H5-b e 33 ng para N1-f. Durante a prova de conceito, observaram-se desafios de reprodutibilidade e ruído de fundo, atribuídos à contaminação de reagentes e degradação por RNases. A adoção de procedimentos de manipulação controlados e o uso de inibidores de RNase permitiram que o sensor N1-f exibisse luminescência superior ao controle negativo. Análises termodinâmicas indicaram que a robustez do sensor N1-f pode estar relacionada à sua elevada frequência de MFE (24,38%), que reduz a exposição de regiões de fita simples ao ataque enzimático. O presente trabalho enfatiza que a estratégia de Toehold switches em plataformas cell-free é promissora para a vigilância do H5N1, embora dependa do controle de RNases e do design de sensores estruturalmente estáveis.