Efeito de mutações sítio-dirigidas no supressor viral de silenciamento gênico do pepper ringspot virus

Abstract

Pepper pingspot virus (PepRSV) ou Tobravirus capsici, se trata de um vírus da família Vigaviridae, gênero Tobravirus, cujo genoma é bissegmentado, composto pelo RNA1 e RNA2, encapsidados individualmente. Ambos os segmentos são ssRNA+, apresentando uma estrutura CAP na extremidade 5’ e uma estrutura “tRNA-like” na região 3’. No Brasil, o PepRSV foi relatado infectando pimenta (Capsicum annum), tomateiro (Solanum lycopersicum L.), batata (Solanum tuberosum) e solano-violeta (Solanum. violaefolium), e recentemente foi descrito causando danos em batata (Solanum tuberosum) na África do Sul. Entre os genes envolvidos no processo de infecção do PepRSV destaca-se o supressor viral de silenciamento gênico (Viral Suppressor of RNA silencing = VSR) p16, localizado no RNA1. O objetivo deste trabalho foi avaliar o impacto de deleções sítio-dirigidas no VSR sobre a virulência e o silenciamento gênico induzido por RNAi, visando gerar variantes atenuadas. Foram realizadas deleções sítio-dirigidas de dois códons de cisteína (TGC/TGT) presentes em diferentes regiões do RNA1 do isolado CAM2, resultando em três diferentes construções: construção 1 (Δ6306-6308nt e Δ6321-6323nt); 2 (Δ6375-6377nt e Δ6378-6380nt) e 3 (com as quatro deleções de códons de cisteínas combinadas). Uma quarta construção, denominada ΔVSR, foi obtida a partir da remoção completa do gene p16. Os mutantes de clones infecciosos foram construídos por meio da montagem de Gibson-Assembly. As modificações foram confirmadas por Sanger. Para os ensaios biológicos, as construções de RNA1 e RNA2 foram infiltradas via Agrobacterium tumenfaciens cepa GV3101::pM90 em 20 plantas de Nicotiana benthamiana para cada ensaio. As construções de RNA2 foram: (i) clone 2 (selvagem); (ii) RNA2-LAV-PDS, contendo 500 pb do gene phytoene desaturase (PDS); e (iii) clone 4, que induz necrose devido a uma inserção de citidina na capa proteica (CP). Os resultados indicaram que as construções com o gene p16 deletado (ΔVSR) ou com cisteínas deletadas no RNA1 (construções 1-3), combinados com RNA2 dos clones 2 ou 4, demonstraram atenuação dos sintomas do isolado Ag1 pelas deleções no VSR. A carga viral das construções derivadas de RNA1 de CAM2 foi mensurada via RT-qPCR. Os dados da quantificação absoluta por RT-qPCR foram submetidos à análise de variância (ANOVA), que revelou diferenças significativas entre os tratamentos em todos os tempos analisados (7, 14 e 21 dpi), com valores de p< 0,001 em todos os pontos experimentais para ambos os segmentos de RNA (RNA1 e RNA2). O isolado tipo selvagem apresentou níveis de acúmulo viral superior às demais construções para ambos os segmentos de RNA. As construções 1-3 exibiram níveis intermediários de acúmulo viral ao longo do tempo, sugerindo que tais deleções no VSR comprometem parcialmente a função do VSR. Por outro lado, a construção com o gene completamente deletado, ΔVSR, apresentou níveis reduzidos e decrescentes de cópias virais, indicando forte prejuízo na capacidade de manutenção da infecção. O isolado selvagem apresentou altíssima replicação inicial, de ~6,46 × 10⁷ cópias de RNA1 e ~4,56×106 cópias de RNA2 aos 7 dpi. A Construção 1 apresentou um crescimento contínuo e replicação moderada, com ápice de ~3,1 × 10⁶ cópias aos 21 dpi. Nesse mesmo período, seu RNA2 teve um declínio no número de cópias, caindo de ~1,60 x 105 cópias aos 7 dpi para ~1,10 x 105 cópias aos 21 dpi. A Construção 2 apresentou a maior carga viral para RNA1 com um número de cópias de ~4,9 × 10⁶ aos 21 dpi, enquanto seu RNA2 chegou aos 21 dpi com aproximadamente 1,62 × 10⁵ cópias. Por sua vez, a Construção 3 apresentou um perfil intermediário, mesmo possuindo o maior número de deleções de cisteínas entre as três construções, com ápice de ~2,3 × 10⁶ cópias de RNA1 e ~5,68× 10⁵ cópias de RNA2 aos 21 dpi. A construção com o p16 deletado (ΔVSR), apresentou uma baixa carga viral para ambos os segmentos de RNA, com ~4,0 × 10⁵ cópias de RNA1 e ~1,60 × 10⁵ cópias de RNA2 aos 21 dpi. O tratamento com planta sadia, obteve valores entre 16 e 700 cópias em todos os tempos para RNA1 e RNA2, indicando um ruído basal. Os resultados também sugerem que, quando as construções do RNA1 (com deleções incorporadas ao seu genoma) são agroinfiltrados conjuntamente com o RNA2-LAV-PDS, há a indução de baixos níveis de silenciamento gênico pós-transcricional (PTGS) e replicação viral para RNA2-LAV-PDS. Além disso, os dados obtidos são altamente relevantes para o desenvolvimento de vetores virais de expressão heteróloga. A eficiência desses sistemas depende de um equilíbrio entre replicação viral e viabilidade do hospedeiro. Enquanto o selvagem apresenta alta capacidade replicativa, sua elevada virulência limita sua aplicabilidade. Em contraste, as Construções 1-3, que apresentam o VSR parcialmente funcional, exibem um perfil mais adequado, permitindo infecção sustentada com menor impacto fisiológico, o que favorece a expressão estável de proteínas recombinantes. Por fim, a atenuação dos sintomas do clone 2 e clone 4 (mutante), indicam que a integridade estrutural do VSR é essencial para sua virulência.