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Please use this identifier to cite or link to this item: https://repositorio.unb.br/handle/10482/39473
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Title: Expressão heteróloga e caracterização bioquímica de amilases putativas de bactérias termófilas
Authors: Silva Neto, Mario Pereira da
Orientador(es):: Noronha, Eliane Ferreira
Assunto:: Amilases
Biologia molecular - enzimas
Enzimologia
Expressão heteróloga
Issue Date: 29-Sep-2020
Citation: SILVA NETO, Mario Pereira da. Expressão heteróloga e caracterização bioquímica de amilases putativas de bactérias termófilas. 2020. 78 f., il. Dissertação (Mestrado em Biologia Molecular)—Universidade de Brasília, Brasília, 2020.
Abstract: Amilases estão entre as hidrolases mais utilizadas em processos biotecnológicos, podendo ser aplicadas em indústrias têxteis, alimentícias, de detergentes, de produção de papel e de biocombustíveis. O fato de as amilases apresentarem uma grande relevância no mercado mundial de enzimas e de os microorganismos termófilos produzirem enzimas mais resistentes a processos industriais faz com que haja um crescente interesse em termoamilases. Neste contexto, o presente trabalho teve como objetivos a clonagem e expressão de genes putativos de amilases das bactérias termófilas Clostridium thermocellum (Cthe_0795 e Cthe_2191) e Paenibacillus barengoltzii (Amy1), e a caracterização das proteínas heterólogas para avaliar seu potencial de aplicação industrial. Análises de bioinformática para todos os genes foram realizadas, incluindo mapeamento de domínios conservados, predição de peptídeo sinal, alinhamentos de sequências e montagem de árvore filogenética com diferentes amilases já caracterizadas provenientes de procariotos. Os três genes Cthe_0795, Cthe_2191 e Amy1 contêm o domínio GH13 das glicosil hidrolases, com identidade de 84,52% com “pululanases” (Best hit: Hungateiclostridium mesophilum), 92,40% com “glycogen branching enzymes” (Best hit: Hungateiclostridium straminisolvens), e 91,93% com “alfa amilases” (Best hit: Paenibacillus rubinfantis). Cthe_0795, Cthe_2191 e Amy1 foram clonados em Escherichia coli BL-21 DE3 utilizando pET 21a; pGEM T e pET21a; e pET21a, respectivamente. A proteína recombinante codificada por Cthe_2191, GlB, foi parcialmente purificada e apresentou atividade enzimática sobre amilose. A proteína recombinante codificada por amy1, AMYPb, foi purificada e caracterizada bioquimicamente, apresentando maior atividade na temperatura de 60°C e pH nas faixas 7 e 8. A enzima manteve 40% da sua atividade após 3 horas de incubação a 50°C, e em torno de 80% quando incubada a 50oC por 2 horas em pH 7, 8 e 9. Os íons CaCl2, MgCl2, MnCl2, KCl, NaCl, CuCl2, NiCl2 e EDTA, nas concentrações de 1mM e 10mM não alteraram a sua atividade, sendo completamente inibida por FeCl3 a 10mM. Tais propriedades bioquímicas fornecem uma boa perspectiva inicial para a aplicação de AMYPb em processos biotecnológicos carreados em condições de temperaturas elevadas e pHs alcalinos baseados na hidrólise do amido, por exemplo.
Abstract: Amylases are among the most frequently used hydrolases in biotechnological processes and can be applied in textile, food, detergents, papermaking and biofuel industries. Amylases shows a remarkable relevance in enzymes’ world market and thermophilic microorganisms produce more resistant enzymes for industrial processes. Thus, there is a crescent interest in thermoamylases. In this context, the present work aimed the cloning and expression of thermophilic bacteria amylase putative genes from Clostridium thermocellum (Cthe_2191; Cthe_0795) and Paenibacillus barengoltzii (Amy1), and the biochemical characterization of heterologous protein to evaluate their industrial application potential. Bioinformatics analysis for the 3 genes were made, including identification of conserved domains, signal peptide prediction, sequence alignments and construction of phylogenetic tree with different characterized amylases from prokaryotic microorganisms. The three genes Cthe_0795, Cthe_2191 and Amy1 contain the glycoside hydrolases GH13 domain, with 84.52% of identity with “alpha-glycosidases” (Best hit: Hungateiclostridium mesophilum), 92.40% with “glycogen branching enzymes” (Best hit: Hungateiclostridium straminisolvens), and 91.93% with “alpha-amylases” (Best hit: Paenibacillus rubinfantis). Cthe_0795, Cthe_2191 and Amy1 were cloned into Escherichia coli BL-21 DE3 using pET 21a; pGEM T and pET21a; and pET21a, respectively. The recombinant protein codified by Cthe_2191, GlB, was partially purified and showed enzymatic activity under amylose. The recombinant protein codified by Amy1, AMYPb, was purified and biochemically characterized, showing higher activity at 60oC and pH 7 and 8. The enzyme retained 40% of activity after 3 hours of incubation at 50oC and retained about 80% when incubated for 2h at 50oC at pHs 7, 8 and 9. The ions CaCl2, MgCl2, MnCl2, KCl, NaCl, CuCl2, NiCl2 and EDTA, at concentrations of 1mM and 10mM, had no effect on Amy1 activity, being completely inhibited by FeCl3 at 10mM. This biochemical properties give a initial good perspective about the potential of application of AMYPb in biotechnological processes that are made on elevated temperature and alkaline pH conditions based on starch’s hydrolysis, for example.
Description: Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2020.
Licença:: A concessão da licença deste item refere-se ao termo de autorização impresso assinado pelo autor com as seguintes condições: Na qualidade de titular dos direitos de autor da publicação, autorizo a Universidade de Brasília e o IBICT a disponibilizar por meio dos sites www.bce.unb.br, www.ibict.br, http://hercules.vtls.com/cgi-bin/ndltd/chameleon?lng=pt&skin=ndltd sem ressarcimento dos direitos autorais, de acordo com a Lei nº 9610/98, o texto integral da obra disponibilizada, conforme permissões assinaladas, para fins de leitura, impressão e/ou download, a título de divulgação da produção científica brasileira, a partir desta data.
Agência financiadora: Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq); Fundação de Apoio à Pesquisa do Distrito Federal (FAP/DF) e Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES).
Appears in Collections:CEL - Mestrado em Biologia Molecular (Dissertações)

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